细胞冻存是一种通过低温保存细胞的方法，旨在长时间维持细胞的活性和功能。这种技术对于细胞系的长期保存、实验的重复性、基因库的建立以及细胞治疗的储备等方面都至关重要。冷冻保存能够有效减少细胞在传代过程中的遗传变异，并避免由于污染、环境变化或实验操作失误造成的细胞损失。最佳的冷冻时间通常是在细胞处于快速生长阶段时。

冷冻保护剂是细胞冻存过程中不可或缺的成分，常见的包括二甲基亚砜（DMSO）和甘油。这些保护剂的主要功能是降低溶液的冰点，并减少冰晶的形成，以保护细胞免受冰晶带来的机械损伤。虽然DMSO适用于大多数细胞类型，但某些细胞可能对其敏感，此时可考虑使用甘油作为替代品。

第一阶段：冷冻保存实验步骤

1. 在冷冻管上标记日期、研究人员姓名、细胞编号、传代数和细胞类型，并添加其他相关信息（如基因改造）。

2. 对于贴壁细胞，首先去除细胞培养基，用PBS洗涤，再加入适量的胰蛋白酶覆盖细胞，在37°C培养箱中孵育约2分钟（具体时间需依据细胞类型调整）。接着，加入等量的培养基终止消化，并使用移液枪轻轻吹打以冲洗细胞，最后转移至50 mL Falcon管中。

3. 对于悬浮细胞，将所需体积直接转移到50 mL Falcon管中。

4. 使用血细胞计数器计数细胞以评估其活力，确保活力至少为75%。

5. 在室温下以300×g离心5分钟。

6. 准备冻存培养基（见表1），确保在使用前充分混合并加热至37°C。

不同细胞类型的冻存培养基配方

细胞类型 | 冻存培养基配方
在含有FBS的培养基中培养的细胞 | 90%胎牛血清 + 10%二甲基亚砜
在无血清培养基中培养的细胞 | 90%条件培养基 + 10%二甲基亚砜
需要甘油冷冻的细胞 | 90%胎牛血清 + 10%甘油

7. 小心去除上清液。

8. 加入冻存培养基至所需细胞密度，哺乳动物细胞浓度通常为1×10⁶/mL。注意，细胞在冻存液中的停留时间不应超过10分钟。

9. 将1 mL样品分装到冷冻管中，盖紧盖子。

10. 将冷冻管转移至室温的冷冻盒中，然后置于-80°C冰箱中。需在冷冻盒外周加入适量的异丙醇，以确保温度以每分钟1°C的速度下降，防止细胞内冰晶的形成。

11. 大约24小时后，将冷冻管取出，转移至液氮中进行长期储存。一般情况下，细胞可在液氮中保存数年，理想情况下不应在-80°C下长期保存（最多一周），以防对细胞活力造成损害。

第二阶段：解冻冷冻细胞系实验步骤

1. 从液氮储存器中取出冷冻管，迅速放入37°C水浴中解冻，直至约80%解冻（切勿在室温下解冻），此过程不应超过1分钟。

2. 使用移液器将冷冻管中的内容物转移至含约10 mL预热培养基的15 mL Falcon管中。

3. 以300×g离心5分钟，弃上清液，使用适量培养基重新悬浮细胞沉淀。

4. 将细胞悬液转移到培养器皿中，并放入37°C培养箱中培养。

通过严格遵循上述步骤，可以有效地进行细胞冻存与解冻操作，确保细胞在未来的研究中依然保持其生命力和功能。这些技术对生物医疗领域的发展具有重要的意义，人生就是博-尊龙凯时全力支持这一方向的探索与创新。