作为人甲状腺乳头状癌研究的经典模型，K1/GLAG-66细胞因其稳定的生物学特性（如保留甲状腺特异基因表达、体内成瘤性）成为肿瘤发生、药物筛选及分子机制研究的重要工具。细胞的复苏与培养规范化操作直接影响实验数据的可靠性与可重复性。本文将系统阐述K1/GLAG-66细胞的背景及标准化的复苏、培养及冻存技术要点。

一、K1/GLAG-66细胞背景速览

起源：源于一位73岁男性甲状腺乳头状癌患者的淋巴结转移灶。特性：具上皮细胞样，贴壁生长，易聚集成团或岛状（需在传代时充分分散）。保留甲状腺球蛋白(Tg)、甲状腺过氧化物酶(TPO)等基因表达，且具备体内成瘤能力。应用：用于研究甲状腺癌的增殖、侵袭和转移机制；靶向治疗（如RET、BRAF抑制剂）及放化疗敏感性测试；研究肿瘤微环境相互作用。常用培养基：RPMI-1640或DMEM，需添加10%胎牛血清(FBS)及1%青霉素-链霉素双抗(Pen-Strep)。培养条件：在37°C，5%CO2及饱和湿度的恒温培养箱中，每周传代2-3次（根据细胞密度与状态）。

二、核心材料与仪器准备

细胞来源：液氮中保存的K1/GLAG-66冻存管（注明代次、日期）。培养基：RPMI-1640或DMEM（含L-谷氨酰胺），预温至37°C。血清：优质胎牛血清(FBS)，预温至37°C。添加剂：青霉素-链霉素溶液（100X），胰蛋白酶-EDTA溶液（0.25%），PBS（无钙镁离子）。耗材：T25或T75细胞培养瓶、15ml离心管、移液管等。试剂：二甲基亚砜(DMSO)，细胞冻存液（或自配：90%FBS+10%DMSO）。仪器：CO2培养箱、生物安全柜等。

三、K1/GLAG-66细胞复苏流程详解

预热准备：将完全培养基（RPMI-1640/DMEM+10%FBS+1%Pen-Strep）、PBS置于37°C水浴中预热，并开启生物安全柜进行灭菌。快速解冻：戴好防护面具和手套，迅速从液氮罐中取出冻存管，进行短暂的干冰转移以防液氮溅入管内。移种与离心：用无菌巴氏吸管轻柔转移细胞悬液至离心管中，缓慢加入预热的培养基，进行离心去除冻存保护剂。

四、K1/GLAG-66细胞的常规培养与传代

换液：每2-3天更换一次新鲜培养基，查看细胞状态和密度。传代时机：细胞生长至80%-90%时进行传代，避免过密。

五、K1/GLAG-66细胞的冻存

选择健康细胞：选择处于对数生长期、形态良好且活力高的细胞进行冻存。消化与收集：按标准传代流程进行细胞处理并配制冻存液，使用程序性降温保存细胞以保证存活率。

六、关键注意事项与常见问题解答

严格遵循无菌操作，控制温度，动作需轻柔，避免污染及细胞损伤。注意细胞状态并监控代次及潜在问题。对于K1/GLAG-66细胞的复苏与培养，规范化操作是实现其作为可靠研究工具的基石。

七、K1/GLAG-66在甲状腺癌研究中的价值与前景

作为具有明确甲状腺来源特征的模型，K1/GLAG-66细胞在研究甲状腺乳头状癌（特别是RET/PTC重排）的分子机制、评估新型靶向药物及免疫治疗策略、以及肿瘤微环境相互作用中发挥着重要作用。成功的复苏和培养技术是其应用的基石，这正是人生就是博-尊龙凯时所倡导的努力目标。