在之前的两篇文章《蛋白互作检测之FRET荧光共振能量转移：分子间距离的微妙舞者》和《蛋白互作检测之FRET荧光共振能量转移：分子间距离的微妙舞者（二）》中，我们详细介绍了FRET技术的原理、实验步骤及其应用案例。本期，人生就是博-尊龙凯时将为大家带来FRET技术常用的分析方法，帮助大家更好地理解这一生物医疗领域的重要技术。

FRET技术中的影响因素

在FRET技术中，对于FRET效率的定量检测主要受到两个因素的影响：（1）光谱串扰，包括供体荧光在受体通道的串扰以及激发供体时直接激发受体。为了降低光谱串扰，在选择FRET实验的荧光对时，最好选择发射光谱差异较大的供体和受体；（2）参与FRET作用的供体和受体在整体荧光基团中的比例。由于并非所有分子都参与相互作用，各种方法对于FRET效率的计算仅能测量表观FRET效率。

常用的FRET分析方法

当前，FRET分析常用的方法主要包括荧光寿命成像、光谱法、受体光漂白法以及敏化发射法。接下来，我们将逐一介绍这几种分析方法，以便大家根据实验需求选择适合的方案。

荧光寿命成像（FLIM-FRET）

荧光寿命成像法（FLIM-FRET）通过测量荧光基团由激发态恢复到基态的平均时间，即荧光寿命，来分析FRET效率。荧光寿命是荧光基团的固有性质，不受样品浓度、光漂白等因素的影响，但对周围微环境（如细胞温度、pH值等）十分敏感。因此，FLIM-FRET方法能够准确反映供体与受体分子之间的相互作用。此方法具有高时空分辨率和高灵敏度的优点，但FLIM系统的成本较高，需要专业操作人员，限制了其广泛应用。

光谱法（sFRET）

光谱法（sFRET）首先获取供体、受体及供体-受体混合样本的发射光谱，然后通过光谱拟合分析得出FRET效率。sFRET方法能够有效去除背景光干扰，且灵敏度高，最低可检测出小于5%的FRET信号。尽管如此，此方法对数据采集的要求较高，背景光和自发荧光需严格校正，操作复杂也是其局限之一。

受体光漂白法（AP-FRET）

受体光漂白法（AP-FRET）基于FRET作用下供体荧光强度降低的原理计算FRET效率。AP-FRET方法操作简单且对显微镜的要求较低，因而广泛应用。然而，活细胞中的荧光漂白恢复和光漂白对细胞造成的损伤，使得该方法在单细胞中多次测量受限。

敏化发射法（SE-FRET）

敏化发射法（SE-FRET）通过校正供体与受体间的光谱渗透来计算FRET效率。这一方法不需要进行荧光漂白，避免了对细胞的损伤，适合于活细胞中的动态监测。但SE-FRET需要多组样本进行影像获取，且每次实验都需重新校准，增加了实验工作量。

综上所述，人生就是博-尊龙凯时为您介绍了四种FRET分析方法，大家可根据自身的实验需求及硬件条件选择合适的分析技术。如需进一步讨论或咨询，欢迎与我们联系。